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活细胞跟踪DNA，RNA等核酸的空间散布和动态变化关于了解基因抒发调控机制具有十分遑急的好奇神往好奇神往。开端于细菌和古细菌体内的获取性免疫系统CRISPR-Cas系统由于其特异性靶向DNA/RNA的才气，已被庸俗设备成多种细胞内DNA/RNA的遗传操作和检测标记的器具。

中国科学院分子细胞科学罕见蜕变中心（生升天学与细胞生物学究诘所）陈玲玲究诘组前期构建了基于CRISPR-dCas13的RNA标记系统，并兑现了活细胞和斑马鱼胚胎内RNA的成像跟踪以及活细胞RNA多色成像 (Yang et al.， Mol Cell， 2019; Huang et al.， Genome Bio， 2023; Yang et al.， Cell Insight， 2022)。而靶向DNA的CRISPR-Cas9系统经校正后可用于活细胞DNA成像标记 (Chen et al.， Cell， 2013; Ma et al.， Nat Biotechnol， 2016)。这些CRISPR系统在标记内源核酸序列方面清楚出其专有的上风，但是关于非类似DNA/RNA序列的活细胞特异性成像当今还存在着诸多端正。

近日，陈玲玲究诘组在Nature Methods上发表了著述CRISPR array-mediated imaging of non-repetitive and multiplex genomic loci in living cells。 该究诘对现存CRISPR-dCas12a系统进行筛选优化，构建了可用于非类似序列DNA活细胞成像的CRISPRdelight系统；进一步使用CRISPRdelight系统，揭示了基因位点在细胞核内定位与其通顺才气和转录活性的关联性；同期足下RNA适配体修饰的CRISPR串联序列兑现了对4种卫星DNA的活细胞多色成像。

CRISPR-Cas12a系统属于类型V的CRISPR-Cas眷属，在靶向DNA的同期还具备将CRISPR串联序列加工成多条熟悉crRNA的才气 （Zetsche， B. et al.， Cell， 2015） 。因此CRISPR-Cas12a系统表面上不错通过CRISPR串联序列在并吞细胞内抒发实够数目crRNA从而兑现非类似序列DNA的标记。

为了考证这一猜思，究诘东谈主员登第了已报导能显贵提升基因编订成果的三种dLbCas12a突变体，并对它们标记微卫星DNA Sat I和Sat III才气进行了相比，发现hyperdLbCas12a突变体 （D156R，D235R，D292R，D350R） 不错兑现更高的标记成果和信号质料。究诘东谈主员进一步发现hyperdLbCas12a不错加工CRISPR串联序列并守护与顺利抒发熟悉crRNA近似的DNA标记才气，同期筛选出了大致抒发长达50次crRNA类似序列的CAG脱手子，并基于此建筑了用于活细胞DNA成像的CRISPRdelight系统。

究诘东谈主员针对CCAT1转录肇始位点上游10kb的区域想象了48条gRNA，使用CRISPRdelight系统胜利兑现了CCAT1基因位点的活细胞标记。以通常的神气，CRISPRdelight系统在其他6个非类似序列基因位点均得到了灵验考证，况且该系统在HCT116，U2OS以及小鼠胚胎干细胞 （R1） 中通常灵验。CRISPRdelight系统相较于之前报谈的基于CRISPR-dCas9的CARGO活细胞标记系统 （Gu， B. et al.，Science， 2018） ，具有质粒构建资本低、周期短、可抒发gRNA数目多、标记系统构成更精辟等多方面优点。

究诘东谈主员足下CRISPRdelight系统进一步分析了CCAT1在细胞核内的散布特色和通顺特征，发现位于细胞核膜处Lamin卵白层的CCAT1位点通顺才气领会弱于位于细胞核内的CCAT1位点，进一步检测CCAT1的内含子抒发信号发现Lamin卵白层的CCAT1位点转录活性也更弱。同期究诘东谈主员对HSPH1，HSPA1A等热休克基因进行了标记，在向细胞施加42°C或亚砷酸钠刺激后，发现定位于核斑的HSPH1基因位点会领会增多，况且位于核斑的基因位点转录活性也领会更强。这些收尾标明了基因组DNA的细胞核内空间位置与其通顺才气和抒发活性的关联性。

终末，究诘东谈主员通过RNA结构优化，胜利将BoxB、Pepper、PP7和MS2 等RNA适配子元件插入至gRNA中动漫 porn，足下CRISPRdelight系统和这些元件对应的和会荧光卵白，兑现了微卫星DNA Sat I、Sat II、Sat III和Sat α的活细胞四色标记（图 1）。CRISPRdelight系统为究诘活细胞中DNA位点的空间位置和能源学特征，提供了更浅显和便利的新技巧。

图1. 使用CRISPRdelight同期标记多个基因组DNA位点

该究诘责任东要由分子细胞罕见中心陈玲玲组杨良中博士 （已毕业） 、敏逸晖硕士、刘昱昕博士生共同完成，陈玲玲究诘员为该论文的通信作家。该项责任得到霍华德休斯医学究诘所Zhe (James) Liu素质、复旦大学生物医学究诘院/复旦大学附庸儿科病院杨力究诘员、清华大学王海峰博士的大肆复古。

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Graphical Abstract

大师点评

陈匡时（北京大学，究诘员）

CRISPR/dCas9成像系统的发展使得对大肆染色质位点进行成像成为可能。该系统足下失去切割活性的Cas9卵白突变体 （dCas9） ，通过对dCas9进行荧光标记，或者校正single guide RNA (sgRNA)（如插入MS2、pepper等适配体） 使其大致被荧光标记，从而兑现对主见染色质位点的成像。尽管CRISPR/dCas9体系是当今最庸俗应用于活细胞基因构成像的系统，但其在多重检测 （multiplexing，即足下靶向不同序列的多个sgRNA标记并吞个基因位点或多个基因位点） 方面存在一定的局限性。具体来说，足下CRISPR/dCas9进行多重检测频繁需要构建多个带有不同sgRNA的质粒或慢病毒来兑现多种sgRNA在并吞个细胞中的同期转录。但是，这类步伐可能导致不同细胞中sgRNA数目和种类的个体各别，从而影响对主见基因组在多个细胞中的高效检测。进一步究诘清楚，通过单一质粒转录多个sgRNA的步伐，如CARGO体系，不错克服这一问题。但是，这类步伐需要将多个sgRNA抒发元件 （如U6-sgRNA转录单位） 引入并吞个质粒中，合成要领复杂且成果低。此外，多个脱手子的同期存在还可能使得每个sgRNA的转录互相竞争，导致多个靶向的sgRNA无法同期存在，进而影响主见基因位点的高效标记。

为了发展更适用于多重检测的活细胞基因构成像器具，陈玲玲课题组基于开端于CRISPR系统V型的CRISPR-Cas12a (Cpf1) 体系，发展了一种名为CRISPRdelight的新式标记时间。与CRISPR-Cas9不同，CRISPR-Cas12a具备加工本人CRISPR RNA (crRNA) 的才气，而这一才气在去除CRISPR-Cas12a的DNA切割活性后仍然得以保留。课题组以hyperdLbCas12a这一变体当作CRISPR-delight的效应卵白，并构建带有多个能与hyperdLbCas12a伙同的crRNA的单一阵列RNA，阐述了荧光标记的hyperdLbCas12a在单基因位点的检测贤人度和标记成果方面，相较于基于CRISPR-dCas9的CARGO成像体系更具上风。此外，除了对hyperdLbCas12a进行荧光标记，课题组还阐述了不错通过校正crRNA，使其含有不同种类的适配体 （包括MS2、PP7， Pepper和BoxB） 从而兑现四色成像。

总体来说，CRISPRdelight时间不仅具备很高的拓展性，在多重检测方面也比基于CRISPR/dCas9的体系更有上风。通过进一步优化CRISPRdelight时间中的荧光团遴荐、crRNA结构以及Cas12a的脱靶效应等方面，有望使其成为鼓励三维基因组学、细胞生物学等究诘限制发展的遑急器具。

大师点评

马涵慧（上海科技大学，究诘员）

东谈主类基因组中含有 2万多个编码基因以及深广的非编码基因和调控元件。基因组DNA的三维结构与动态变化在基因转录调控、细胞分化、个体发育以及疾病发生历程中至关遑急。用于究诘基因组DNA三维结构的步伐宽广，比如基于高通量DNA测序的Hi-C、基于超分手率显微镜的MERFISH等，当今照旧集结了深广的数据用于分析和探索基因组DNA三维结构与功能的关系。但基因组DNA在活细胞中动态变化越过功能究诘严重滞后，主要原因是短少一个高效、及时成像非类似序列DNA （包括基因或基因的调控元件） 的器具。好意思国国立卫生究诘院资助的4D 核体策划 II期 （4D Nucleome Program） 把基因组及时动态变化和功能当作需要打破的要点施行之一。

基于CRISPR的活细胞DNA成像时间不错灵验地示踪基因组中类似序列的动态变化，但是及时成像非类似序列DNA仍至极艰辛，主要的瓶颈在于其信噪比 （Signal-to-Noise Ratio） 低，亚细胞定位和永劫分示踪齐至极具有挑战性。因此这一限制究诘东谈主员一直尽力于怎样提升信号和裁减杂音，期待兑现高效、及时成像基因组DNA越过在基因调控历程中的动态变化。中国科学院分子细胞科学罕见中心的陈玲玲课题组和其协作家近期设备的CRISPRdelight，高明地责罚的这一难题。

提升信号的步伐主要通过加多特定区域内靶向位点的数目 （tiling array of gRNAs） 比如CARGO系统， 或对单个靶向位点的信号放大比如Casilio或CRISPR FISHer。这些系统齐是基于CRISPR-dCas9，其中CARGO系统需要至少12个sgRNAs的阵列，每个sgRNA需要单独U6脱手子按捺转录，终末拼装在一个质粒载体里，导致制备历程复杂，而每个sgRNA抒发量的均一度也没法保证。CRISPRdelight是基于CRISPR-dCas12a，充分足下了Cas12a 不错处理来自CRISPR 阵列中单个转录本的多个sgRNAs，简化了sgRNA阵列的制备历程，保证了sgRNA阵列的均一性，极地面提升了基于CRISPR DNA成像的成果和贤人度。

基因在细胞核内的定位和动态变化与基因转录活性和转录后加工的关系一直倍数柔顺。核斑 （Nuclear speckles） 和基因活性商量，富含深广RNA剪接因子，被以为参与剪接功能与调控。通过CRISPRdelight系统发现存内含子的基因在基因激活的时候会重定位到核斑名义，为基因转录与RNA裁剪的偶联机制提供了新的字据，示意着通过DNA的重定位使重生pre-mRNA被运送（sorting）到剪切机器富集的核斑进行转录后加工。

通过与RNA适配体 （RNA aptamers） 伙同，CRISPRdelight还不错成为多色系统用于同期不雅察多个DNA位点，为进一步究诘DNA环互相作用 （DNA loop interactions） 比如增强子-脱手子、增强子-增强子、脱手子-脱手子、脱手子-阻隔子等互相作用越过功能奠定了追究的基础。进一步迭代CRISPRdelight多色系统，曩昔也不错在活细胞中示踪环挤压 （loop extrusion） 历程。鉴于其庸俗的应用远景，CRISPRdelight系统将成为鼓励三维基因组学到四维基因组学 （时分为第四维度） 的有劲器具之一。

https://www.nature.com/articles/s41592-024-02333-3动漫 porn